Der er nogle værktøjer til at forudsige bindingen:

1. TargetScan (baseret på seed match [primær], ekstra parring, sekvenskontekst ¹ - nukleotidsammensætning omkring stedet osv [sekundær])
2. miRanda (baseret på hybridiseringsstabilitet og frøtilpasning [primær] og sekvenskontekst [ sekundær])
3. PicTar (tilføjer et lag af evolutionære bevaringskriterier)

^{1 Kontekst betyder placeringen af ​​målstedet i 3'UTR og den omgivende nukleotidsammensætning (som også betragtes som en indirekte metrisk sekundær struktur)}

miRanda og TargetScan har også klasser kaldet konserverede og ikke-konserverede mål. miRanda rapporterer miRSVR scores og TargetScan rapporterer kontekst scores, men disse mål er baseret på få eksperimentelle resultater og kan ikke altid være meningsfulde. miRSVR er baseret på ændring i målekspression ved miRNA-overekspression / knockdown. Det bruger også metrics til målwebsitekontekst. Context + -score for TargetScan inkluderer mange metrics, der inkluderer måloverflod og bevarelse sammen med den regelmæssige kontekstscoring. Nogle af disse målinger kan være mere nyttige end de andre. Men score baseret på miRNA OE / KD-eksperimenter kan være vildledende - især hvis målekspression kvantificeres lige på RNA-niveau. Måloverfladen varierer også mellem forskellige celletyper. For flere detaljer om disse metrics henvises til papirerne, der svarer til disse værktøjer.

Der er nogle eksperimentelle procedurer til målbestemmelse, der hovedsageligt involverer protein-RNA-tværbinding efterfulgt af immunudfældning af Ago og efterfølgende kvantificering ved RNA-sekventering. Se HITS-CLIP og PAR-CLIP. Disse teknikker finder ikke virkelig målene. Alt hvad de gør er at korrelere niveauerne af miRNA og deres forudsagte mål knyttet til Ago (du ved ikke nøjagtigt, om det ternære mRNA-miRNA-Ago -kompleks virkelig er dannet eller ej).

CLASH er en nyere teknik, der forsøger at løse dette problem ved at ligere mRNA med miRNA. På denne måde kan du fange interaktionen mellem miRNA og mRNA. Jeg er dog lidt skeptisk over for CLASH; Jeg arbejdede selv på dette princip for nogen tid tilbage og stod over for denne ene udfordring. CLASH involverer nogenlunde følgende trin:

• Tværbinding protein-RNA
• Immunoprecipitate Ago
• Brug RNAse til at fordøje ubundet regioner af mRNA (og gøre det lille nok til et kortlæst sekventeringseksperiment)
• Ligat miRNA og mRNA bundet til Ago ved hjælp af RNA ligase
• Degrade Ago ved hjælp af protease
• Sekvens af miRNA-mRNA-ligeret par

Min tvivl var, hvordan ville miRNA og mRNA blive ligeret, når fodaftrykket af Ago er større end et miRNA (rapporteret ~ 50-60 nt i HITS-CLIP og PAR-CLIP). Når RNA er nukleasebeskyttet, hvordan kan det da være tilgængeligt for ligase. Da jeg tænkte på det, tænkte jeg, at en delvis proteinnedbrydning var nødvendig (efter RNAse-trin og før ligasetrin) for at give lidt plads til ligase at virke. Til sidst arbejdede jeg ikke videre med det. Tre år senere blev CLASH-papir udgivet, og jeg var glad for, at nogen fik det til at fungere. Men ligase-problemet blev ikke behandlet (det ser ud til at have fungeret, men jeg ved ikke hvordan !!).

For at teste forudsigelserne kan du bruge et reporterassay (såsom GFP eller Luciferase) med 3'UTR klonet nedstrøms for reporteren. Disse kan også have artefakter. Overudtryk af miRNA bør undgås, og frømutationer skal udføres for at fastslå målretningen.

En anden teknik til bestemmelse af et mål-mRNA er at maskere dets forudsagte miRNA-bindingssted og se effekten på ekspressionen. Dette er blevet gjort i zebrafisk ved hjælp af morpholinos, der supplerer målsites, men ikke på andre modeller AFAIK. Dette forekommer mig som et elegant assay - ingen overekspression, og du kan præcist bestemme målwebstedet.

Jeg vil grundigt kontrollere litteraturen om den UTR, du er interesseret i, meget af dette er allerede blevet gjort for mange genomiske regioner siden næste generation seq begyndte.

Du vil først og fremmest bruge beregningsforudsigelsesalgoritmer til at hjælpe dig med at få en god kandidatliste over miRNA'er

Interaktionen mellem et miRNA og dets mål-mRNA'er undersøges normalt af co -transfektion af en reporterekspressionsvektor indeholdende 3'-UTR-regionen i mRNA'et og et hæmmende eller forløbermolekyle for miRNA'et.

Men dette måler ikke den direkte og fysiske interaktion mellem et miRNA og et specifikt mRNA. For mere specifikt at måle binding skal du udføre et ElectroMobility Shift Assay.

Her er et kommercielt værktøj, der fungerer godt, hvis du bare prøver at identificere det.

http: //www.activemotif.com/catalog/905/lightswitch-synthetic-mirna-target-reporter-collection

Jeg tror ikke, der er andre meget effektive / nemme metoder.

Jeg antager, at du kunne gøre noget som at hybridisere det, køre hyben på en gel, pope ud bandet og seq det