Spørgsmål:
Hvordan finder man miRNA-bindingssteder på et specifikt gen?
ecagl
2014-10-25 19:54:00 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Jeg prøver at finde miRNA'er, der binder til 3'UTR for et specifikt gen. Hvad er den bedste måde at gøre det på (det vil sige med en god score-analyse, der oftest bruges af forskere på dette område)? Jeg vil også gerne vide de andre mulige metoder, hvis der er flere måder at gøre dette på.

Godt spørgsmål her
Fik du det svar, du ønskede?
Bioinformatisk del af dit svar kan være bedre, det er derfor, jeg ikke gav fuld kredit. For dem, der også gerne vil vide mere om værktøjer til at finde miRNA-målwebsted, kan de tjekke denne artikel. Det er virkelig godt: http://journal.frontiersin.org/Journal/10.3389/fgene.2014.00023/fullTak, fordi du forresten minder mig om spørgsmålet.
@user1445 Jeg forstår ikke, hvad du mener? Vil du have oplysninger om disse bioinformatikværktøjer? Hvis du spørger det, vil jeg betragte spørgsmålet som bredt. Som du kan se, tager det en hel artikel at forklare disse ting.
To svar:
WYSIWYG
2014-10-27 12:22:46 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Der er nogle værktøjer til at forudsige bindingen:

  1. TargetScan (baseret på seed match [primær], ekstra parring, sekvenskontekst 1 - nukleotidsammensætning omkring stedet osv [sekundær])
  2. miRanda (baseret på hybridiseringsstabilitet og frøtilpasning [primær] og sekvenskontekst [ sekundær])
  3. PicTar (tilføjer et lag af evolutionære bevaringskriterier)

1 Kontekst betyder placeringen af ​​målstedet i 3'UTR og den omgivende nukleotidsammensætning (som også betragtes som en indirekte metrisk sekundær struktur)

miRanda og TargetScan har også klasser kaldet konserverede og ikke-konserverede mål. miRanda rapporterer miRSVR scores og TargetScan rapporterer kontekst scores, men disse mål er baseret på få eksperimentelle resultater og kan ikke altid være meningsfulde. miRSVR er baseret på ændring i målekspression ved miRNA-overekspression / knockdown. Det bruger også metrics til målwebsitekontekst. Context + -score for TargetScan inkluderer mange metrics, der inkluderer måloverflod og bevarelse sammen med den regelmæssige kontekstscoring. Nogle af disse målinger kan være mere nyttige end de andre. Men score baseret på miRNA OE / KD-eksperimenter kan være vildledende - især hvis målekspression kvantificeres lige på RNA-niveau. Måloverfladen varierer også mellem forskellige celletyper. For flere detaljer om disse metrics henvises til papirerne, der svarer til disse værktøjer.

Der er nogle eksperimentelle procedurer til målbestemmelse, der hovedsageligt involverer protein-RNA-tværbinding efterfulgt af immunudfældning af Ago og efterfølgende kvantificering ved RNA-sekventering. Se HITS-CLIP og PAR-CLIP. Disse teknikker finder ikke virkelig målene. Alt hvad de gør er at korrelere niveauerne af miRNA og deres forudsagte mål knyttet til Ago (du ved ikke nøjagtigt, om det ternære mRNA-miRNA-Ago -kompleks virkelig er dannet eller ej).

CLASH er en nyere teknik, der forsøger at løse dette problem ved at ligere mRNA med miRNA. På denne måde kan du fange interaktionen mellem miRNA og mRNA. Jeg er dog lidt skeptisk over for CLASH; Jeg arbejdede selv på dette princip for nogen tid tilbage og stod over for denne ene udfordring. CLASH involverer nogenlunde følgende trin:

  • Tværbinding protein-RNA
  • Immunoprecipitate Ago
  • Brug RNAse til at fordøje ubundet regioner af mRNA (og gøre det lille nok til et kortlæst sekventeringseksperiment)
  • Ligat miRNA og mRNA bundet til Ago ved hjælp af RNA ligase
  • Degrade Ago ved hjælp af protease
  • Sekvens af miRNA-mRNA-ligeret par

Min tvivl var, hvordan ville miRNA og mRNA blive ligeret, når fodaftrykket af Ago er større end et miRNA (rapporteret ~ 50-60 nt i HITS-CLIP og PAR-CLIP). Når RNA er nukleasebeskyttet, hvordan kan det da være tilgængeligt for ligase. Da jeg tænkte på det, tænkte jeg, at en delvis proteinnedbrydning var nødvendig (efter RNAse-trin og før ligasetrin) for at give lidt plads til ligase at virke. Til sidst arbejdede jeg ikke videre med det. Tre år senere blev CLASH-papir udgivet, og jeg var glad for, at nogen fik det til at fungere. Men ligase-problemet blev ikke behandlet (det ser ud til at have fungeret, men jeg ved ikke hvordan !!).

For at teste forudsigelserne kan du bruge et reporterassay (såsom GFP eller Luciferase) med 3'UTR klonet nedstrøms for reporteren. Disse kan også have artefakter. Overudtryk af miRNA bør undgås, og frømutationer skal udføres for at fastslå målretningen.

En anden teknik til bestemmelse af et mål-mRNA er at maskere dets forudsagte miRNA-bindingssted og se effekten på ekspressionen. Dette er blevet gjort i zebrafisk ved hjælp af morpholinos, der supplerer målsites, men ikke på andre modeller AFAIK. Dette forekommer mig som et elegant assay - ingen overekspression, og du kan præcist bestemme målwebstedet.

rhill45
2014-10-26 05:07:22 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Jeg vil grundigt kontrollere litteraturen om den UTR, du er interesseret i, meget af dette er allerede blevet gjort for mange genomiske regioner siden næste generation seq begyndte.

Du vil først og fremmest bruge beregningsforudsigelsesalgoritmer til at hjælpe dig med at få en god kandidatliste over miRNA'er

Interaktionen mellem et miRNA og dets mål-mRNA'er undersøges normalt af co -transfektion af en reporterekspressionsvektor indeholdende 3'-UTR-regionen i mRNA'et og et hæmmende eller forløbermolekyle for miRNA'et.

Men dette måler ikke den direkte og fysiske interaktion mellem et miRNA og et specifikt mRNA. For mere specifikt at måle binding skal du udføre et ElectroMobility Shift Assay.

Her er et kommercielt værktøj, der fungerer godt, hvis du bare prøver at identificere det.

http: //www.activemotif.com/catalog/905/lightswitch-synthetic-mirna-target-reporter-collection

Jeg tror ikke, der er andre meget effektive / nemme metoder.

Jeg antager, at du kunne gøre noget som at hybridisere det, køre hyben på en gel, pope ud bandet og seq det

Tak for svaret, men mit spørgsmål var faktisk meget mere simpelt. Indtil videre leder jeg bare efter en god kandidatliste over miRNA'er. Jeg har fundet et websted (http://www.microrna.org/microrna/home.do) til dette, og det er baseret på mirSVR-score. Er dette en god måde at vælge kandidat-miRNA'er på? Er der andre måder at finde kandidat-miRNA'er på, der er baseret på forskellige algoritmer?
Jeg troede, du skrev specifikt gen?
ja "Indtil videre leder jeg bare efter en god kandidatliste over miRNA'er til et specifikt gen (genet efter eget valg)". Så jeg vil vælge et specifikt gen i databasen, og jeg vil have, at databasen viser mig en liste over mirnaer, der kan binde til det gen's 3'UTR. Jeg vil også se ansvaret for mirna-binding via en scoringsmetode som mirSVR. Jeg har hidtil kun fundet mirSVR og den nævnte hjemmeside, men er der andre måder, og hvad er den bedste måde at søge efter i litteraturen? undskyld, hvis jeg ikke opretholder den korrekte terminologi, er jeg relativt ny i dette.


Denne spørgsmål og svar blev automatisk oversat fra det engelske sprog.Det originale indhold er tilgængeligt på stackexchange, som vi takker for den cc by-sa 3.0-licens, den distribueres under.
Loading...